PCR基因擴增實驗室

PCR基因擴增實驗室介紹和標準▩•₪：

PCR實驗室又叫基因擴增實驗室╃☁·。PCR是聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)的簡稱╃☁·。是一種分子生物學技術│₪•·，用於放大特定的DNA片段│₪•·，可看作生物體外的特殊DNA複製╃☁·。透過DNA基因追蹤系統│₪•·，能迅速掌握患者體內的病毒含量│₪•·，其精確度高達奈米級別╃☁·。

PCR基因擴增實驗室平面圖

PCR擴增檢驗實驗室原則上分為三個單獨的工作區域▩•₪：試劑貯存和準備區·₪▩₪│、標本製備區·₪▩₪│、擴增和擴增產物分析區╃☁·。為避免交叉汙染│₪•·，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行│₪•·，即只能從試劑貯存和準備區→標本製備區→擴增和擴增產物分析區╃☁·。各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應透過傳遞窗進行╃☁·。

(1)試劑貯存和準備區

該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的製備·₪▩₪│、試劑的分裝和主反應混合液的製備╃☁·。試劑和用於樣品製作的材料應直接運送至該區│₪•·，不得經過其他區域╃☁·。試劑原材料必須貯存在本區內│₪•·，並在本區內製備成所需的貯存試劑╃☁·。對與氣流壓力的控制│₪•·，本區應對外界保持微正壓╃☁·。

(2)標本製備區

該區域主要進行的操作為樣本的儲存·₪▩₪│、核酸(RNA·₪▩₪│、DNA)提取·₪▩₪│、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成╃☁·。本區的壓力梯度要求為▩•₪：相對於鄰近區域為正壓│₪•·，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠汙染╃☁·。另外│₪•·，由於在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的汙染│₪•·，所以應避免在本區內不必要的走動╃☁·。

(3-4)擴增和擴增產物分析區

該區域主要進行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定╃☁·。此外│₪•·，已製備的DNA模板(來自樣本製備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和製備區)製備成反應混合液等也可在本區內進行╃☁·。本區的壓力梯度要求為▩•₪：相對於鄰近區域為負壓│₪•·，以避免氣溶膠從本區漏出╃☁·。為避免氣溶膠所致的汙染│₪•·，應儘量減少在本區內的不必要的走動╃☁·。個別操作如加樣等應在超淨臺內進行╃☁·。

PCR區完成以後│₪•·，需要分析樣品並解釋資料│₪•·，應該留出一個專門用於反應後處理樣品的地方╃☁·。後PCR活動中使用的所用試劑·₪▩₪│、一次性耗材和儀器都必須是專門用於這一目的│₪•·，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用於任何前PCR活動╃☁·。產物分析區如使用全自動分析儀│₪•·，區域可適當合併╃☁·。

(5)緩衝區與沖洗區

整個區域有一個整體緩衝走廊╃☁·。每個獨立實驗區設定有緩衝區│₪•·，同時各區透過氣壓調節│₪•·，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的汙染並降低擴增產物對人員和環境的汙染╃☁·。

可開啟緩衝區Ⅰ│₪•·，緩衝區Ⅱ和PCR擴增區的排風扇往外排氣│₪•·，在實驗區的外牆上和各扇門上都安裝有風量可調的迴風口│₪•·，空氣透過迴風口向室內換氣╃☁·。外面有用於實驗後消毒│₪•·，消毒區域有專用清洗液和專用潔淨洗手池│₪•·，以及消毒紙巾╃☁·。

若房間進深允許│₪•·，可設PCR內部專用走廊╃☁·。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面│₪•·，緩衝間比專用走廊更有意義╃☁·。

各個區域之間應具備單向的實驗工藝流·₪▩₪│、物流·₪▩₪│、人流與氣流│₪•·，形成單向流程的保護屏障│₪•·，避免實驗之間的相互干擾│₪•·，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成汙染產生假性結果╃☁·。

PCR實驗室案例欣賞

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以下為科瓦特設計的疾控中心PCR基因擴增實驗室的整體建設▩•₪：

1·₪▩₪│、主體結構▩•₪：

主體為彩鋼板·₪▩₪│、鋁合金型材╃☁·。室內所有陰角·₪▩₪│、陽角均採用鋁合金50內圓角鋁│₪•·，從而解決容易汙染·₪▩₪│、積塵·₪▩₪│、不易清掃等問題╃☁·。結構牢固│₪•·，線條簡明│₪•·，美觀大方│₪•·，密封性好╃☁·。

2·₪▩₪│、標準的三區分隔和氣壓調節▩•₪：

將PCR過程分成試劑準備·₪▩₪│、標本製備和PCR擴增·₪▩₪│、分析三個（或）四個獨立的實驗區╃☁·。整個區域有一個整體緩衝走廊╃☁·。每個獨立實驗區設定有緩衝區│₪•·，同時各區透過氣壓調節│₪•·，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的汙染並降低擴增產物對人員和環境的汙染╃☁·。

可開啟緩衝區Ⅰ│₪•·，緩衝區Ⅱ和PCR擴增區的排風扇往外排氣│₪•·，在實驗區的外牆上和各扇門上都安裝有風量可調的迴風口│₪•·，空氣透過迴風口向室內換氣╃☁·。

3·₪▩₪│、消毒▩•₪：

在三個實驗區和三個緩衝區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈│₪•·，供消毒用╃☁·。在試劑準備區和標本製備區還設定移動紫外線燈│₪•·，對實驗桌進行區域性消毒╃☁·。

4·₪▩₪│、機械連鎖不鏽鋼傳遞窗▩•₪：

試劑和標本透過機械連鎖不鏽鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞│₪•·，保證試劑和標本在傳遞過程中不受汙染（人物分流）╃☁·。

5·₪▩₪│、地面

地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面│₪•·，整體性好╃☁·。便於進行清掃│₪•·，耐腐蝕╃☁·。沒有條件的也可採用水磨石地面│₪•·，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小於2mm╃☁·。

6·₪▩₪│、照明

 

燈具要選用淨化燈具│₪•·，能達到便於清洗·₪▩₪│、不積塵的特點╃☁·。

科瓦特PCR實驗室案例展示▩•₪：

                      生物安全標識                                                   產物擴增區

                        PCR標本製備區                                         PCR緩衝區

                            PCR洗手消毒區                                          PCR沐浴換衣區

   PCR通風與消防區 （不同區域工作人員衣服不同）                    PCR負壓控制區

在建設的過程中應注意▩•₪：

●規範的安裝流程和全面的服務流程╃☁·。

●嚴格按照規範科學設計的安裝流程╃☁·。

●安裝前需要確定以下安裝條件│₪•·，如▩•₪：電源電壓│₪•·，電源進線位置│₪•·，電話網路線進線位置│₪•·，進水水壓│₪•·，最小安裝空間│₪•·，地面平整度│₪•·，通風孔·₪▩₪│、進水管和下水管的位置等│₪•·，理想狀態的空間尺寸和通風口尺寸╃☁·。

PCR即聚合酶鏈式反應│₪•·，是分子生物學研究和實驗的常規方法│₪•·，也是生物學·₪▩₪│、醫學臨床等領域廣泛應用的實驗技術╃☁·。其特點是能將微量的DNA大幅增加╃☁·。實驗室分為四個區域│₪•·，進入各工作區域必須嚴格按照單一方向進行│₪•·，不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）╃☁·。工作人員離開各工作區域時│₪•·，不得將工作服帶出│₪•·，

PCR整體實驗室區域分別為▩•₪：

1.試劑配製區

2.樣品處理區

3.核酸擴增區

PCR實驗室可以是分散形式│₪•·，也可以是組合形式╃☁·。完成一組PCR實驗│₪•·，通常應經過試劑配製·₪▩₪│、樣品處理·₪▩₪│、核酸擴增及產物分析四個實驗過程│₪•·，若實驗工藝需要│₪•·，還應增加樣品粉碎過程╃☁·。

一·₪▩₪│、分散形式PCR實驗室

所謂分散形式PCR實驗室│₪•·，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠│₪•·，呈分散佈置形式╃☁·。對於這種佈置形式的PCR實驗室│₪•·，由於各個實驗之間不易相互干擾│₪•·，因此無需特殊條件要求╃☁·。

二·₪▩₪│、組合形式PCR實驗室

所謂組合形式PCR實驗室,是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰佈置│₪•·，組成獨立實驗區域的形式╃☁·。對於組合形式PCR實驗室│₪•·，由於各個實驗間集中佈置│₪•·，容易造成相互干擾│₪•·，因此│₪•·，對總體佈局以及屏障系統具有一定的要求╃☁·。各室在入口處設緩衝間│₪•·，以減少室內外空氣交換╃☁·。試劑配製室及樣品處理室宜呈微正壓│₪•·，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入│₪•·，造成汙染；核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓│₪•·，以防含核酸的氣溶膠擴散出去汙染試劑與樣品╃☁·。

如果使用熒光PCR儀│₪•·，擴增室和產物分析室可以合併╃☁·。

若房間進深允許│₪•·，可設PCR內部專用走廊╃☁·。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面│₪•·，緩衝間比專用走廊更有意義╃☁·。

各個區域之間應具備單向的實驗工藝流·₪▩₪│、物流·₪▩₪│、人流與氣流│₪•·，形成單向流程的保護屏障│₪•·，避免實驗之間的相互干擾│₪•·，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成汙染產生假性結果╃☁·。

實驗室的牆體│₪•·，包括頂棚│₪•·，應結構牢固·₪▩₪│、氣密性好；所有陰角宜採用圓弧形線條過渡；牆體內壁光潔·₪▩₪│、不吸附·₪▩₪│、耐腐蝕·₪▩₪│、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙·₪▩₪│、無滲漏·₪▩₪│、光潔·₪▩₪│、耐腐蝕的要求.╃☁·。

擬設定臨床基因擴增檢驗實驗室的醫療機構按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設定標準》籌建實驗室；籌建完成後│₪•·，由法定代表人向衛生部臨檢中心提出技術驗收申請╃☁·。

申請時需提交以下材料▩•₪：

（一）《醫療機構執業許可證》影印件；

（二）可行性研究報告；

1·₪▩₪│、擬設臨床基因擴增檢驗實驗室機構的所在地醫療衛生資源狀況·₪▩₪│、本機構的基本情況·₪▩₪│、對臨床基因擴增檢驗的需求以及臨床基因擴增實驗室執行的預測分析；

2·₪▩₪│、擬設臨床基因擴增檢驗實驗室的設定平面圖；

3·₪▩₪│、擬設臨床基因擴增檢驗實驗室將開展的檢驗專案·₪▩₪│、實驗裝置條件和有關技術人員資料

PCR實驗室驗收條件▩•₪：

1根據衛生部臨檢中心規定│₪•·，凡是根據需要開展PCR檢測實驗室建設的醫療機構均透過衛生臨床檢驗中心實驗室驗收並取得合格證書方可開展工作╃☁·。二級以上醫院方可設立PCR實驗室│₪•·，含專科醫院╃☁·。

2驗收規定▩•₪：

三級醫院由衛生部臨床檢驗中心組織專家（一般均為各省臨床檢驗中心主任）進行│₪•·，二級醫院由各個省臨床檢驗中心組織專家（一般為本省醫療機構主任級別專家）進行驗收╃☁·。按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設定標準》對提出申請的臨床基因擴增檢驗實驗室進行技術驗收╃☁·。驗收完成後│₪•·，在20日內將驗收報告寄送至申請機構╃☁·。

驗收人員組成▩•₪：一個驗收小組一般為3人│₪•·，其中一人為聯絡小組組長│₪•·，其他為其他省臨床檢驗中心主任或者本省醫院內任職專家╃☁·。

PCR實驗室所在科室規定▩•₪：根據規定│₪•·，PCR檢測應該由各醫院的檢驗科開展│₪•·，其他科室如傳染科│₪•·，皮膚科等│₪•·，要求開展並申請驗收的│₪•·，應該事先由各省臨床檢驗中心認可╃☁·。

PCR實驗室人員規定▩•₪：根據規定│₪•·，PCR實驗室操作人員至少2名│₪•·，且有PCR上崗培訓合格證╃☁·。

PCR實驗室裝置▩•₪：PCR實驗室內所需要的醫療裝置均需要取得相關醫療器械註冊許可證│₪•·，檢測試劑均需要取得新藥證書和藥品生產文號│₪•·，熒光定量PCR不得使用超過五年╃☁·。

PCR實驗室認證實施規定▩•₪：

PCR實驗室認證驗收時│₪•·，均會給定未知標本5份（一般是HBV-DNA│₪•·，可能是近一兩年的衛生部臨床檢驗中心室間質控品）│₪•·，要求待認證實驗室做實驗並列印報告單作為驗收的重要實驗依據╃☁·。一般要求5份標本的定量結果必須在範圍值之內│₪•·，否則不合格╃☁·。

PCR實驗室各區域管理規定▩•₪：
 

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試劑準備區工作制度

一·₪▩₪│、實驗人員進入該區須更換工作服│₪•·，穿本區專用綠色工作服│₪•·，戴帽子·₪▩₪│、口罩及更換專用拖鞋╃☁·。

二·₪▩₪│、實驗員在試劑準備區接收標本·₪▩₪│、準備實驗用的試劑╃☁·。

三·₪▩₪│、實驗員每天收齊標本│₪•·，驗收登記後│₪•·，將標本透過傳遞窗送入標本製備區╃☁·。四·₪▩₪│、在試劑準備區配置好試劑後放入冰箱內備用╃☁·。需要時透過傳遞窗送入標本製備區╃☁·。

五·₪▩₪│、每天的標本及配置的試劑須登記記錄│₪•·，應書寫工整詳細│₪•·，使用本區專用的·₪▩₪│、帶有本室標識的記錄本·₪▩₪│、紙和筆╃☁·。

六·₪▩₪│、將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中│₪•·，有專人將垃圾帶出實驗室交醫院集中處理╃☁·。

七·₪▩₪│、實驗後須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗檯面│₪•·，紫外燈消毒30分鐘│₪•·，記錄紫外燈·₪▩₪│、冰箱·₪▩₪│、離心機等儀器的使用情況╃☁·。

標本製備區工作制度

一·₪▩₪│、實驗人員進入該區須更換工作服│₪•·，穿上本區專用藍色工作服│₪•·，戴帽子·₪▩₪│、口罩及更換專用拖鞋╃☁·。

二·₪▩₪│、把已準備好的試劑放入冰箱試劑存放專區暫存╃☁·。

三·₪▩₪│、記錄溫溼度計讀數·₪▩₪│、冰箱的溫度╃☁·。

四·₪▩₪│、嚴格按照SOP檔案及試劑盒要求進行實驗操作│₪•·，加樣好的PCR管須透過傳遞窗送入擴增及產物區╃☁·。

五·₪▩₪│、使用本區專用的移液器及吸頭│₪•·，使用過的離心管·₪▩₪│、吸頭須置於盛有含氯消毒液的廢液缸中│₪•·，實驗完畢後及時處理╃☁·。將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中│₪•·，有專人將垃圾帶出實驗室交醫院集中處理╃☁·。

六·₪▩₪│、使用本區專用的帶有本區標識的記錄本·₪▩₪│、紙和筆│₪•·，其他區的用品不得帶入本區╃☁·。

七·₪▩₪│、實驗完畢關閉所有儀器│₪•·，記錄儀器使用時間和執行狀態╃☁·。

八·₪▩₪│、實驗後須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗檯面│₪•·，紫外燈消毒30分鐘│₪•·，記錄紫外燈·₪▩₪│、冰箱·₪▩₪│、離心機等儀器的使用情況╃☁·。

擴增及產物分析區工作制度

一·₪▩₪│、實驗人員進入該區須更換工作服│₪•·，穿上本區專用粉紅色工作服│₪•·，戴帽子·₪▩₪│、口罩及更換專用拖鞋╃☁·。

二·₪▩₪│、記錄溫溼度計讀數·₪▩₪│、冰箱的溫度╃☁·。

三·₪▩₪│、本區主要進行目的基因的擴增及分析│₪•·，須熟悉各擴增儀的使用│₪•·，擴增分析完後│₪•·，記錄結果╃☁·。

四·₪▩₪│、得到當天室內質控結果後│₪•·，及時記錄在室內質控圖上並進行分析╃☁·。

五·₪▩₪│、試驗完畢後關掉擴增儀│₪•·，記錄儀器使用時間和執行狀態╃☁·。

六·₪▩₪│、每週由實驗室負責人對進行清潔維護並記錄╃☁·。

七·₪▩₪│、擴增分析完後的反應管│₪•·，須裝入本室垃圾袋中│₪•·，有專人將垃圾帶出實驗室交醫院集中處理╃☁·。

八·₪▩₪│、使用本區專用的帶有本區標識的記錄本·₪▩₪│、紙和筆│₪•·，其他區的用品不得帶入本區╃☁·。

九·₪▩₪│、實驗後須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗檯面│₪•·，紫外燈消毒30分鐘│₪•·，記錄紫外燈·₪▩₪│、冰箱·₪▩₪│、離心機等儀器的使用情況╃☁·。